PCR, yw'r adwaith cadwyn polymeras, sy'n cyfeirio at ychwanegu dNTP, Mg2+, ffactorau elongation a ffactorau gwella ymhelaethu i'r system o dan gatalysis DNA polymeras, gan ddefnyddio'r rhiant DNA fel templed a paent preimio penodol fel man cychwyn yr estyniad, Trwy'r camau dadnatureiddio, anelio, ymestyn, ac ati, gall y broses o atgynhyrchu DNA llinyn y ferch in vitro sy'n ategu'r templed llinyn rhiant DNA ymhelaethu'n gyflym ac yn benodol ar unrhyw DNA targed in vitro.
1. PCR Cychwyn Poeth
Nid amser cychwyn ymhelaethu mewn PCR confensiynol yw rhoi'r peiriant PCR yn y peiriant PCR, ac yna mae'r rhaglen yn dechrau ymhelaethu.Pan fydd cyfluniad y system wedi'i gwblhau, mae'r ymhelaethiad yn dechrau, a all achosi ymhelaethu amhenodol, a gall PCR cychwyn poeth ddatrys y broblem hon.
Beth yw PCR cychwyn poeth?Ar ôl i'r system adwaith gael ei pharatoi, mae'r addasydd ensymau yn cael ei ryddhau ar dymheredd uchel (fel arfer yn uwch na 90 ° C) yn ystod cam gwresogi cychwynnol yr adwaith neu'r cam “cychwyn poeth”, fel bod y DNA polymeras yn cael ei actifadu.Mae'r union amser actifadu a thymheredd yn dibynnu ar natur y DNA polymeras a'r addasydd cychwyn poeth.Mae'r dull hwn yn bennaf yn defnyddio addaswyr fel gwrthgyrff, ligandau affinedd, neu addaswyr cemegol i atal gweithgaredd DNA polymeras.Gan fod gweithgaredd DNA polymeras yn cael ei atal ar dymheredd ystafell, mae technoleg cychwyn poeth yn darparu cyfleustra gwych ar gyfer paratoi systemau adwaith PCR lluosog ar dymheredd ystafell heb aberthu penodoldeb adweithiau PCR.
2. RT-PCR
Mae RT-PCR (PCR trawsgrifio o chwith) yn dechneg arbrofol ar gyfer trawsgrifio gwrthdro o mRNA i cDNA a'i ddefnyddio fel templed ar gyfer ymhelaethu.Y weithdrefn arbrofol yw echdynnu cyfanswm RNA mewn meinweoedd neu gelloedd yn gyntaf, defnyddio Oligo (dT) fel paent preimio, defnyddio trawsgrifiad gwrthdro i syntheseiddio cDNA, ac yna defnyddio cDNA fel templed ar gyfer ymhelaethu PCR i gael y genyn targed neu ganfod mynegiant genynnau.
3. PCR meintiol fflwroleuol
PCR meintiol fflwroleuol (PCR Meintiol Amser Real,RT-qPCR) yn cyfeirio at y dull o ychwanegu grwpiau fflwroleuol i'r system adwaith PCR, gan ddefnyddio'r casgliad o signalau fflwroleuol i fonitro'r broses PCR gyfan mewn amser real, ac yn olaf defnyddio'r gromlin safonol i ddadansoddi'r templed yn feintiol.Mae dulliau qPCR a ddefnyddir yn gyffredin yn cynnwys SYBR Green I a TaqMan.
4. PCR nythu
Mae PCR nythu yn cyfeirio at ddefnyddio dwy set o preimwyr PCR ar gyfer dwy rownd o ymhelaethu PCR, a chynnyrch mwyhau'r ail rownd yw'r darn genyn targed.
Os bydd diffyg cyfatebiaeth rhwng y pâr cyntaf o baent preimio (preimwyr allanol) yn achosi i gynnyrch amhenodol gael ei chwyddo, mae'r posibilrwydd y bydd yr un rhanbarth amhenodol yn cael ei gydnabod gan yr ail bâr o baent preimio a pharhau i ymhelaethu yn fach iawn, felly mae'r ymhelaethu gan yr ail bâr o preimio, mae penodoldeb PCR wedi'i wella.Un fantais o berfformio dwy rownd o PCR yw ei fod yn helpu i chwyddo digon o gynnyrch o DNA cychwynnol cyfyngedig.
5. Touchdown PCR
Mae Touchdown PCR yn ddull i wella penodoldeb adwaith PCR trwy addasu paramedrau cylchred PCR.
Yn PCR touchdown, mae'r tymheredd anelio ar gyfer yr ychydig gylchoedd cyntaf wedi'i osod ychydig raddau uwchlaw tymheredd anelio uchaf (Tm) y paent preimio.Gall tymheredd anelio uwch leihau ymhelaethu amhenodol yn effeithiol, ond ar yr un pryd, bydd tymheredd anelio uwch yn gwaethygu gwahanu paent preimio a dilyniannau targed, gan arwain at lai o gynnyrch PCR.Felly, yn yr ychydig gylchoedd cyntaf, mae'r tymheredd anelio fel arfer yn cael ei osod i ostwng 1 ° C y cylch i gynyddu cynnwys y genyn targed yn y system.Pan fydd y tymheredd anelio yn cael ei ostwng i'r tymheredd gorau posibl, cynhelir y tymheredd anelio ar gyfer y cylchoedd sy'n weddill.
6. PCR uniongyrchol
Mae PCR Uniongyrchol yn cyfeirio at ymhelaethu ar DNA targed yn uniongyrchol o'r sampl heb fod angen ynysu a phuro asid niwclëig.
Mae dau fath o PCR uniongyrchol:
dull uniongyrchol: cymerwch ychydig bach o sampl a'i ychwanegu'n uniongyrchol at PCR Master Mix ar gyfer adnabod PCR;
dull cracio: ar ôl samplu'r sampl, ei ychwanegu at y lysate, lyse i ryddhau'r genom, cymerwch ychydig o supernatant lysed a'i ychwanegu at PCR Master Mix, perfformio adnabod PCR.Mae'r dull hwn yn symleiddio'r llif gwaith arbrofol, yn lleihau amser ymarferol, ac yn osgoi colli DNA yn ystod camau puro.
7. SOE PCR
Splicing genynnau trwy estyniad gorgyffwrdd Mae PCR (SOE PCR) yn defnyddio paent preimio gyda phennau cyflenwol i wneud cynhyrchion PCR yn ffurfio cadwyni sy'n gorgyffwrdd, fel bod ffynonellau gwahanol o dechneg A lle mae darnau chwyddedig yn cael eu gorgyffwrdd yn yr adwaith mwyhau dilynol, trwy ymestyn y cadwyni sy'n gorgyffwrdd. a spliced ynghyd.Ar hyn o bryd mae gan y dechnoleg hon ddau brif gyfeiriad cymhwyso: adeiladu genynnau ymasiad;treiglad genyn wedi'i gyfeirio at safle.
8. IPCR
Mae PCR gwrthdro (IPCR) yn defnyddio paent preimio cyflenwol gwrthdro i fwyhau darnau DNA heblaw'r ddau breimiwr, ac yn chwyddo dilyniannau anhysbys ar ddwy ochr darn DNA hysbys.
Dyluniwyd IPCR yn wreiddiol i bennu dilyniant rhanbarthau anhysbys cyfagos, ac fe'i defnyddir yn bennaf i astudio dilyniannau hyrwyddwr genynnau;ad-drefnu cromosomaidd oncogenig, megis ymasiad genynnau, trawsleoli a thrawsosod;ac integreiddio genynnau firaol, hefyd yn cael eu defnyddio'n gyffredin nawr Ar gyfer mwtagenesis a gyfeiriwyd at y safle, copïwch plasmid gyda'r treiglad a ddymunir.
9. dPCR
Mae PCR digidol (dPCR) yn dechneg ar gyfer meintioli absoliwt moleciwlau asid niwclëig.
Ar hyn o bryd mae tri dull ar gyfer meintioli moleciwlau asid niwclëig.Mae ffotometreg yn seiliedig ar amsugnedd moleciwlau asid niwclëig;Mae PCR meintiol fflwroleuol amser real (PCR Amser Real) yn seiliedig ar y gwerth Ct, ac mae'r gwerth Ct yn cyfeirio at y rhif cylch sy'n cyfateb i'r gwerth fflworoleuedd y gellir ei ganfod;PCR digidol yw'r dechnoleg Feintiol ddiweddaraf yn seiliedig ar ddull PCR un moleciwl ar gyfer cyfrif meintioli asid niwclëig yn ddull meintiol absoliwt.
Amser postio: Mehefin-13-2023